ฟอสโฟรีเลชั่นของ
E2F1 บนซีรีน 31 กระตุ้นการจับกับทดลองเล่นสล็อต τ ซึ่งนำไปสู่การทำให้เสถียรของslot E2F1 หลังจากความเสียหายของสล็อตเครดิตฟรี DNA ฟอสโฟรีเลชั่นของซีรีนเกมส์สล็อต888 31 ยังสร้างตำแหน่งที่จับสำหรับโดเมนเว็บสล็อต BRCA1 C-terminal หนึ่งในแปดโดเมนของ TopBP1 TopBP1 ที่จับกับสล็อตออนไลน์ E2F1 ยับยั้งกิจกรรมการถอดรหัสของสล็อตทดลองเล่น E2F1 โดยไม่ขึ้นอยู่กับตัวยับยั้งเนื้องอกเรติโนบลาสโตมา
จากนั้นสล็อตฟรี E2F1 ดูเหมือนจะมีส่วนร่วมในกระบวนการที่ปรับปรุงการรับรู้ความเสียหายและสล็อตแตกง่าย NER ทั่วโลกตลอดทั้งจีโนม โดยย่อ เซลล์ถูกจำลองการบำบัดหรือบำบัดด้วย UVB 500 J/m2 จากนั้นตรึงด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ 1% เป็นเวลา 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง ดำเนินการกระตุ้นภูมิคุ้มกันด้วยแอนติบอดีต่อ E2F1 หรือ E2F2 และ DNA ที่ตกตะกอนนั้นถูกเชื่อมโยงข้ามและทำให้บริสุทธิ์แบบย้อนกลับ
เนื่องจากการจับ DNA และการกลายพันธุ์ของโดเมนทรานส์แอกทีฟเป็นนักสืบสำหรับการเปิดใช้งานการถอดเสียงโดยใช้ E2F1 ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำอย่างยิ่งว่า E2F1 ปรับปรุง GG-NER ในลักษณะที่ไม่ขึ้นกับการถอดความ ตามที่คาดไว้ E2F1 ภายนอกถูกทำให้ล้มลงอย่างมีประสิทธิภาพในขณะที่ FLAG-E2F1 ที่แสดงภายนอกนั้นไม่ได้ (รูปที่ S2A เพิ่มเติม) พลาสมิดที่แสดงโครงสร้าง FLAG-E2F1 ที่แตกต่างกันจะถูกถ่ายกลับเข้าไปในเซลล์ (รูปที่ 5C) เนื่องจากโครงสร้างการกลายพันธุ์ของ E2F1 ที่แตกต่างกันถูกแสดงในระดับที่แตกต่างกัน บางทีอาจเป็นเพราะความแตกต่างในความเสถียรของโปรตีน ปริมาณของพลาสมิดทรานส์เฟกที่เข้ารหัสการกลายพันธุ์ที่แตกต่างกันจึงถูกปรับ อย่างไรก็ตาม ควรชี้ให้เห็นว่าโครงสร้าง E2F1 ทั้งหมดถูกแสดงในระดับที่สูงกว่า E2F1 ภายนอก (รูปที่เสริม S2A, ข้อมูลไม่แสดง)
หลังการฉายรังสี 2 นาที 30 นาที หรือ 3 ชั่วโมง เซลล์ได้รับการแก้ไขและย้อมสีสำหรับ CPD และ E2F1 โดยอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ทางอ้อม C, NHFs ไม่ได้รับการบำบัดหรือฉายรังสีเฉพาะที่ด้วย UVC 50 J/m2 และย้อมสีสำหรับ CPD และ E2F2 หรือ E2F3 ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ฟอสโฟรีเลชั่นของ E2F1 ที่ซีรีน 31 สร้างตำแหน่งที่มีผลผูกพันสำหรับหนึ่งในโดเมน BRCA1 C-terminal ของ TopBP1 และการโต้ตอบนี้ส่งผลให้เกิดการรับสมัคร E2F1 ไปยังไซต์ของ DSB ในการตรวจสอบว่ารังสี UV จะกระตุ้นปฏิกิริยาระหว่าง E2F1 และ TopBP1 ได้หรือไม่ การทดลองการตกตะกอนร่วมได้ดำเนินการกับโปรตีน E2F1 และ TopBP1 ภายในร่างกาย แม้ว่าจะสังเกตเห็นความสัมพันธ์ในระดับต่ำในเซลล์ที่ไม่ได้รับการรักษา แต่การรักษาด้วยรังสียูวีส่งผลให้ความสามารถของ E2F1 เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดในการเพิ่มภูมิคุ้มกันร่วมกับ TopBP1 (รูปที่ 3E)
การใช้เทคนิคการฉายรังสี UV เฉพาะที่และการย้อมสีอิมมูโนฟลูออเรสเซนซ์ แสดงให้เห็นว่า E2F1 สะสมที่บริเวณที่มีความเสียหายของ DNA การแปล E2F1 เป็นภาษาท้องถิ่นไปยัง DNA ที่เสียหายจากรังสี UV นั้นต้องการไคเนสที่เกี่ยวข้องกับ ATM และ Rad3 และซีรีน 31 ของ E2F1 แต่ไม่ใช่โดเมนการจับ DNA ที่ไม่เสียหาย การขาด E2F1 ดูเหมือนจะไม่ส่งผลกระทบต่อการแสดงออกของปัจจัยการซ่อมแซมการตัดตอนของนิวคลีโอไทด์ เช่น XPC และ XPA อย่างไรก็ตาม การลดลงของ E2F1 ทำให้การรับสมัครปัจจัย NER ไปยังจุดที่เสียหายลดลง และลดประสิทธิภาพของการซ่อมแซม DNA การค้นพบนี้แสดงให้เห็นว่า E2F1 มีบทบาทโดยตรงที่ไม่ใช่การถอดความในการซ่อมแซม DNA ซึ่งเกี่ยวข้องกับการเพิ่มปัจจัย NER ไปยังไซต์ที่เสียหาย
สอดคล้องกับสิ่งที่เราค้นพบก่อนหน้านี้
S31A และการกลายพันธุ์ของโดเมนการลดขนาด (Δ206–220) ไม่ได้ช่วยการแปลร่วมที่บกพร่องของ XPA ด้วย CPD ที่เกิดจากการพร่องของ E2F1 ภายนอก แม้ว่า E2F1 Δ283–358 กลายพันธุ์จะแปลเป็นภาษาท้องถิ่นไปยังจุดที่เสียหาย แต่ก็ไม่ได้ช่วยแก้ไขข้อบกพร่องในการแปลร่วมของ XPA ในทางตรงกันข้าม การกลายพันธุ์ของ E2F1 ในโดเมนที่มีผลผูกพันกับ DNA และการทำสำเนาได้ส่งเสริมการรับสมัคร XPA ไปยังไซต์ที่สร้างความเสียหายในระดับเดียวกับประเภทไวด์ E2F1 (รูปที่ 5D และรูปที่ S2B เพิ่มเติม) เพื่อให้เข้าใจถึงการทำงานของ E2F1 ในการซ่อมแซม DNA ที่เกี่ยวข้องกับกิจกรรมที่รู้จักอื่นๆ ได้ดีขึ้น เราได้ทำการทดลองหลายชุดโดยใช้แผงของโครงสร้างนิพจน์ E2F1 ที่ติดแท็ก FLAG (รูปที่ 5A) นอกจากการกลายพันธุ์ของ S31A แล้ว
ในทางกลับกัน E2F1 กลายพันธุ์ในการจับ DNA , Marked box (Δ283–358) และโดเมน C-terminal transactivation (Δ375–437) นั้นมีประสิทธิภาพเทียบเท่ากับ E2F1 ชนิด wild ในความสามารถในการสะสมที่ไซต์ของรังสียูวี ความเสียหาย ดังนั้น การผูกมัดโดยตรงกับ DNA และการโต้ตอบกับพันธมิตรโปรตีนผ่านกล่องทำเครื่องหมายหรือปลายทาง C จึงไม่จำเป็นสำหรับ E2F1 เพื่อระบุตำแหน่งที่เสียหาย การลดขนาดด้วยพันธมิตร DP อาจมีความสำคัญต่อการแปลความเสียหาย แม้ว่าจะเป็นไปได้ที่การลบ Δ206–220 จะส่งผลกระทบต่อฟังก์ชันอื่นที่สำคัญสำหรับการสะสมของ E2F1 ที่ไซต์ความเสียหาย ก่อนหน้านี้เราได้แสดงให้เห็นว่าการไม่มี E2F1 ส่งผลให้การซ่อมแซมความเสียหายของ DNA ที่เกิดจากรังสี UV ไม่มีประสิทธิภาพ ในขณะที่ E2F1 การแสดงออกมากเกินไปจะกระตุ้น GG-NER สิ่งนี้อาจอธิบายได้ว่า E2F1 ซึ่งปกติคิดว่าเป็นปัจจัยที่ก่อให้เกิดการตายของเซลล์ได้อย่างไร
การอยู่รอดโดยใช้ E2F1-mediated เพื่อตอบสนองต่อรังสี UV มีความสัมพันธ์กับผลกระทบต่อการซ่อมแซม DNA ซึ่งบกพร่องเมื่อไม่มี E2F1 และถูกกระตุ้นโดย E2F1 ที่แสดงออกมากเกินไป ที่นี่เราแสดงหลักฐานว่า E2F1 ปรับปรุง GG-NER ผ่านกลไกใหม่ที่เป็นอิสระจากหน้าที่เป็นตัวควบคุมการถอดรหัส ในบรรดาตระกูล E2F นั้น E2F1 มีความเสถียรเป็นพิเศษในการตอบสนองต่อความเสียหายของ DNA หลายประเภท (20,–22) และเรายืนยันการค้นพบนี้ใน NHF หลังจากการฉายรังสี UVB (รูปที่ 1A)
